操作流程

1. 接種50ul菌種至200ml抗性培養基中，37℃培養過夜。
2. 次日加入新鮮抗性培養基至800ml，培養1-2h至細菌活力最旺盛。
3. 加入200ul的1M IPTG(28℃或37℃)誘導3.5h。
4. 收集菌體(66轉/秒×15min)，棄上清，加入30ml抽提液懸浮菌體，加入終濃度1mM PMSF和終濃度0.5mM EDTA（his融合蛋白抽提時不加EDTA），冰浴條件下超聲波200W破碎6min。
5. 搖床4℃孵育 1h。
6. 高速離心，133轉/秒×15min。取上清，加入400ul beads 4℃結合過夜。
7. 收集beads(33轉/秒×5min,同時在4℃保存上清)，用洗滌液洗滌beads，洗去雜蛋白(1ml×3 次)。加入300ul洗脫液, 讓洗脫液與beads充分結合1h，離心收集上清。往beads中再次加入300ul的洗脫液，洗脫1h，離心收集上清，兩次洗脫液合為一管。
8. 將beads用PBS洗滌3次，重新加入所保留的上清中，4℃結合2h，并重復4.2.7的操作步驟。
9. 將4.2.7和4.2.8所得的洗脫液合為一管,混勻后取10ul加入10ul 制樣buffer煮樣，然后與8.3ug/10ul maker（BSA 67kd；GST 26kd）一同上樣，跑膠。膠跑完后考馬斯亮藍染色液，染色1h，用脫色液脫色2h左右。
10. 根據maker的跑膠結果目測蛋白分子量及濃度。
11. 將收集到的融合蛋白放入-20℃冰箱保存并登記位置號。

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使用試劑列表

抽提液(洗滌液) PBST/PBSS?? PH7.4

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PBS?

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LB 培養基

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IPTG

?????????? 1M IPTG in water

?????????? 11.33g IPTG in 40ml ddH20

PMSF

??????????? 100mM in isopropyl alcohol

??????????? 1g PMSF in 57ml isopropyl alcohol

EDTA

??????????? 0.5M in water

??????????? 55.8g EDTA in 300ml ddH20

GST 蛋白洗脫液? PH 8.0

100mM GSH in PBS/T

?????????? 3.07g GSH in 100ml PBS/T

His 蛋白洗脫液? PH 7.0

?????????? 300mM imidazole in PBSS(or PBS)

His 蛋白洗滌液??? PH 7.0?

????? 20mM imidazole in PBSS

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